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EZ-TN5™ 转座体和体内转座的介绍以及常见问题解答

浏览次数: 日期:2015-5-8

EZ-TN5™ Transposomes™ and In Vivo Transposomics™
EZ-TN5 转座体和体内转座
可以对细菌进行改造包括基因遗传改造,降低病原性和基因敲除等。
什么是EZ-Tn5 转座体?
EZ-Tn5™ 转座体(图1)提供了一个快速简单的方法在活细菌中构建一个随机敲除的文库。 该转座体是一个由 EZ-Tn5™  转座子(改进的Tn5转座子)和 EZ-Tn5 转座酶(超活性Tn5转座酶)在不需要Mg 2+的条件下构成的复合体(图2)。
EZ-Tn5 转座体很稳定,可通过电转化转入到活细菌体内。一旦进入细胞, EZ-Tn5 转座酶被宿主细胞内镁离子激活,转座子DNA随机插入到基因组DNA中。没有其他的转座系统如此的方便有效。不需要细胞的结合,自杀载体或特殊的宿主。EZ-Tn5 转座体是一个理想的工具,可快速方便构建随机基因敲除文库,开发新功能菌株用于特殊应用。
转座体三维结构,图为X晶体射线结果,由Wisconsin-Madison大学Ivan Rayment 和 William Reznikoff 提拱
1. Tn5 转座体三维结构,图为X晶体射线结果,由Wisconsin-Madison大学Ivan Rayment 和 William Reznikoff 提拱
EZ-Tn5转座体的有效性及使用方法
EZ-Tn5转座体带有卡纳抗性和二氢叶酸还原酶抗性筛选标签。
EZ-Tn5™ <KAN-2>Tnp (卡纳筛选)
EZ-Tn5™ <DHFR-1>Tnp Transposome ( 甲氧苄氨嘧啶筛选)
将所选择的 EZ-Tn5 转座体电转化至细菌感受态细胞,转化的菌株在卡纳或者是甲氧苄胺嘧啶培养基中筛选。活的克隆即为转座子成功插入基因组DNA的克隆。所获得的转座克隆数取决于宿主细胞转化效率。
EZ-Tn5 转座体系统已经被优化,使平均一个细胞可以获得一个 EZ-Tn5转座子的插入。转座子插入克隆可以通过使用者所知的表型实验来进行筛选,也可以通过基因组测序或PCR来筛选。
广泛的宿主范围
根据文献报道,研究者使用EZ-Tn5转座体已经15年之久,并且在60种不同的宿主中做过尝试。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都可以很好地作为转化宿主。成功的重要条件为感受态细胞的制备,感受态细胞必须具有高的转化效率。
创建自主的 EZ-Tn5 转座体
定制EZ-Tn5 转座体包括一个使用者定义的转座子DNA 序列,可以使用EZ-Tn5™ Custom Transposome™ Construction 盒子来构建获得,转座体包括一个基因,一个常规序列,一个筛选标记等(见图4)
在不需要镁离子的条件下,EZ-Tn5™转座子和转座酶构成了稳定的复合体。
2.在不需要镁离子的条件下,EZ-Tn5™转座子和转座酶构成了稳定的复合体。

EZ-Tn5™转座体可以电转化进入活细胞,并且可以将转座子随机插入进宿主的基因组DNA
3 .EZ-Tn5™转座体可以电转化进入活细胞,并且可以将转座子随机插入进宿主的基因组DNA.

4. 一个定制的EZ-Tn5™转座体被用来在大肠杆菌中插入绿色荧光报告基因(luxCDABE),图中得到的结果是在添加了Hg+,因为载体的启动子为汞依赖启动子。

EZ-Tn5 转座体使用过程中遇到的一些常见问题

1.什么是 EZ-Tn5转座体?
EZ-Tn5™ 转座体是一个由 EZ-Tn5™  转座子和 EZ-Tn5 转座酶构成的复合体, Ez-tn5是EPI的专利产品,是转座子和转座酶在不需要Mg 2+的条件下构成的复合体。
2. EZ-Tn5转座体是使用了一个自杀载体将转座子投递到活细胞的染色体DNA上吗?
不是的。EZ-Tn5转座体的完美之处在于不需要自杀载体。在其他的体内转座系统中自杀载体(如mini-Tn5 和Himar mariner)的目的是提供转座酶基因,该基因是这些系统发挥功能所需要的。为了消除对自杀载体的需求,研究者使用改进的工程EN-Tn5转座酶(超活性的TN5转座酶)在一系列的微生物中提高了转座突变效率。

3.可以使用化学感受态细胞来转化转座体吗?

不可以,化学转化使转座体在细胞表面,通过热击使转座子进入细胞,这有可能使酶没有活性或者转化率很低。
4. 有很多种细菌可以接受 EZ-Tn5转座体吗? 还是转座体只能在革兰氏阳性菌株中发挥功能。
革兰氏阳性菌本身很难发生转座。但是诱导这些微生物有机体发生突变时,转座可以成功,如转座体说明指导中所述。与革兰氏阴性菌相比,阳性菌含有磷壁酸的细胞壁,固有的低转化效率和限制修饰系统降低了转座效率。某些情况下,所使用的筛选标记(不是标准的卡纳或四氢叶酸还原酶基因)需要是阳性菌启动子所偏爱的。我们推荐 pMOD转座体构建载体供研究者产生自己的转座体。谷歌学术可以帮助你查看是否您的宿主使用过EZ-Tn5 转座体。
5. 将转座体转化到我的细菌中,使用什么条件最好?
这由您所使用的微生物决定。在许多微生物中,您可以使用50 ul细胞,1 ul转座体,2毫米电击杯,2500v, 5毫秒的电击时间。转座的克隆数主要决定于您所转化的宿主细胞,内源性的限制修饰系统及感受态细胞的转化效率。

6. 我能使用这个盒子在体外对基因组DNA进行突变吗?

是的,很多文献中都有这样目的的例子,可以查看epicentre相关资料或者从谷歌学术上收索关键词“EZ-Tn5 克隆基因组DNA突变”来找到文献中的例子。
7. 一旦转座子发生跳跃,我得到的转座子能从DNA上跳出吗?
不会的– 已经对转座酶进行了改造,保证稳定的插入,不会出现在DNA上的重排或者删除。
8. 我所要做敲除基因组文库的细菌,对于你们所提供的标准的转座试剂盒中抗性不适用,我该怎么办?
最简单的办法就是通过Epicentre的EZ-Tn5定制转座试剂盒来定制一个你所需要的转座子。这个试剂盒中提供了EZ-Tn5 转座酶, EZ-Tn5 pMOD-2 或 pMOD-3 转座构建载体, 体外所使用的转座buffer, 用于体外对照的空质粒, 从质粒上扩增转座子的PCR引物。 Epicentre 出售两种 pMOD-质粒作为单独的产品。 盒子中还提供 EZ-Tn5 转座酶,这个不单独出售. 从谷歌学术收索中,你可以找到使用这个盒子的发表文章。

9.有没有办法可以缩小我需要的转座酶的量?

可以缩小转座体构建的体系。如果您想使用少量的转座酶,最好就是适当的缩小转座体反应的整个体系。注意,添加低量的甘油,如1微升很困难。
10. 转座体可以用于真菌或哺乳动物细胞吗?
成核的细胞很难使用转座体进行突变。转座体必须通过细胞壁到达细胞质,进而穿过核膜才能够随机插入到染色体中。穿过细胞壁相对容易些,然后转座子在细胞质中停留并在降解前短暂的表达基因,目前为止,使用EZ-Tn5只有原核细胞成功突变的例子,如下:
◦Mouse spermatozoa - Suganuma, et al. (2005) Biology of Reproduction 73, 1157-1163.
◦Saccharomyces cerevisiae - Goryshin, I.Y. et al. (2000) Nature Biotech. 18, 97.
◦Trypanosoma brucei - Shi, H. et al. (2002) Mol. Biochem. Parasitol. 121, 141.
11.我转化了我的细菌,但是我只得到很少的抗性克隆,我期望得到更多的克隆怎么办?
可能因素包括(1) 低的电转化效率 (2) 你所用的细菌含有活跃的,潜在的限制修饰系统 (3) 筛选标记不能很好的在你所用的菌株中表达。
12. 我能够使用EZ-Tn5 TET-1 插入试剂盒体内做一个转座体吗?
是的,文献上有很多报道成功的例子。只需按照步骤制作转座体并将转座体电转化进入细胞中。注意需要添加硫酸镁或醋酸镁在孵育的培养基中(电转化后需要使用),使细胞恢复状态。镁离子可以帮助四环素转运蛋白更有效的去除细胞质中的四环素。

13. 我是第一次使用转座体?在我做实验时候,我需要注意哪些事项?

最好的建议就是严格按照实验步骤操作:
1.确保宿主菌转化效率在106 cfu/µg;
2.确保你所使用的抗性在宿主中可以表达。
3.最好使用的菌株没有内源性的限制修饰系统。 (或者高度降低限制活性)
在线白色页有益提示: 创建细菌突变转座策略给你提供了很好的指导,帮助你设计实施实验。
14. 为了确保成功的转座突变实验,我需要考虑哪些因素?
三个主要的因素影响 EZ-Tn5 t转座突变实验结果◦
第一就是细菌电转化的转化效率。我们推荐电转化效率不低于106 cfu/µg (可以使用可以在菌株中复制的质粒进行验证)。化学转化基本不会成功。
第二转座子的筛选标记必须是敏感的,而且能够在你所用的宿主菌中发挥功能。也可以定制一个转座子含有有效的启动子及筛选标记,已知可以在宿主菌中使用。
最后,内源性的限制修饰系统可以大大的降低转化效率。如果细胞中内源的核酸酶可以识别到作用位点,就可以切割转座子的DNA序列,降低转化效率◦为了解决这个问题,我们提供I型限制修饰系统抑制剂,用于转座子突变。但是这种抑制剂在II型限制修饰系统中不能工作。

15.我已经得到了我想要的突变体,我想直接测序突变体该怎么做?

有三种测序方法:

  1. 标准的全基因组测序,使用标准的ABI BigDye测序引物(试剂盒中提供的)。这种方法,epicentre论坛中讨论过是比较费事,而且不可靠,需要改进标准程序,通过使用更多的扩增数和循环数(比如模板量为3-5微克,50-55个循环代替原来30个循环)
  2. 第二,转座体末端的随机扩增发展起来,并且对操作流程进行了改进,可以咨询epicentre技术支持。程序中使用单引物,90循环PCR,通过BigDye 终端测序,结果简单可靠。可以参考综述:Rapid Identification of EZ-Tn5™ Transposon Insertion Sites in the Genome of Neisseria gonorrhoeae

3.第三种方法也是最新的是使用二代测序对全基因组测序,使用illumina Nextera 和Nextera V2 高通量测序方法。利用该方法可以从一个单一转座子反应获得的多个转座克隆得到测序数据,可以在一个反应中获取转座子插入位点的位置信息。
16.我使用R6Kγ/KAN-2转座体执行了一个筛选标记营救实验,分离了基因组DNA ,并进行了切割转化到宿主菌中(不是EPI EC100D, 在卡纳的平板上没有看到生长,为什么?
有如下建议:

  1. 检查kana使用量

检查连接反应是否有问题

  1. 确保在使用限制酶切割基因组DNA的时候,在营救实验中没有切坏转座子。
  2. 确保基因组DNA连成环状的条件。(通常使用较低的DNA浓度,如10-20ng)

17. 我在我的细菌中做了转座体敲除实验,但是 我没有得到文献中报道的 抗性菌株数量 ,我使用的是相同的菌株。数据可靠吗?为什么我没有得到同样的结果?
如果结果在以前的文献 中有报道,那么数据还是可靠的。看一下你的电泳条件,多数文章对于特定的微生物没有写明电转化的条件。最好的方式就是看一下是否限制酶干扰,降低了细菌转化效率。这些参数可能不同菌株间有很大差别。

18. 当我突变我的某种菌株,我能够期待得到多少敲除突变株?

取决于转化效率和宿主的限制修饰系统及在一个高效的反应中所获得的覆盖度与细菌基因组大小有关。例如:5MB基因组/20000转座子克隆=随机插入大约为250bp。
19. 转化我的物种消耗了大量的DNA,我担心如果要成功转化我的细胞会消耗大量的转座子,即使只获得一个突变。有好的方法解决这个问题吗?
一些微生物有潜在的防御功能抵抗外来的DNA(如病毒,连接质粒等),为了发现为什么会有这样一个问题,最好是回头查找一两步,看看为什么转化细胞消耗了这么多的DNA。例如: (1) 一个活细胞的限制修饰系统或 (2) 整体低的转化效率. 告诉我们关于你细菌的更多信息,我们可以建议您如何构建您微生物的转座突变文库。
20. 我能够定制我所选着基因的EZ-Tn5转座体吗?
是的,但是首先你需要创建一个EZ-tN5转座子(含有任何一段DNA,将其克隆进19bp的马赛克序列中)epicentre提供 pMOD™系列载体带有马赛克序列,可以使得克隆方便些。pMOD载体提供不同的复制起始位点,有助于不同的下游应用。一旦DNAmarker克隆进入pMOD载体,转座子DNA可以通过PCR或者是限制性酶切获得。为了构建您的转座体,混合适量的转座酶,转座子DNA,甘油,室温孵育30分钟,转座体中适当的DNA长度对于转化效率有影响。细菌中最长的转座体(DNA插入长度)约12kb
21. 我能用盒子来测序质粒吗?
是的,可以使用EZ-Tn5体外插入试剂盒测序引物进行测序。每个盒子含有FP-1和RP-1引物,可以结合在插入转座DNA的两端,可以读出转座插入位点的序列。
22. 能告诉我转座子是如何工作的吗?
En-Tz5转座酶在体内或体外,通过在靶DNA上产生一个9个碱基的序列的缺口,然后将转座子DNA的5´-末端连接到缺口DNA的3´-末端来起始插入过程。9个碱基的缺口随后被宿主细胞的DNA聚合酶(或Klenow片段)补平,从而在插入位点两端形成9个碱基的正向重复。这种插入是高度稳定的,通常不能用转座酶直接反转。

 

 

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